เริ่มจากดาวน์โหลดและติดตั้งโปรแกรม Haploview4.2 เปิดโปรแกรมและเลือกไฟล์ข้อมูลเป็น
HapMap Format จากนั้นทำการนำเข้าข้อมูลที่จะศึกษา ในที่นี้คือเลือกไฟล์ dumped_region.dat โดยโปรแกรมมีการติดตั้งค่าตัวแปรมาตั้งแต่ต้น (default parameter) ซึ่งโปรแกรมจะทำการคำนวณเฉพาะสถิติ
pairwise LD สำหรับ marker ที่มีการกำหนดระยะห่างระหว่าง marker ตั้งค่าไว้ที่ 500 kb และจะไม่ทำการ
วิเคราะห์ข้อมูล marker ที่มีผลจีโนไทป์ไม่ถึง 50% (ค่าที่กำหนดไว้สามารถปรับเปลี่ยนได้) จากนั้นโปรแกรม
จะแสดงค่าสถิติต่าง ๆ จากหน้าต่าง check marker ดังนี้
- ObsHET คือ ค่าที่ได้จากการนับ observed heterozygosity
- PredHET คือ ค่าที่ได้จากการคำนวณ predicted heterozygosity (2*MAF*(1-MAF))
- HWpval คือ ค่า p value ของ Hardy-Weinberg equilibrium ซึ่งก็คือค่าโอกาสความน่าจะเป็นที่
ข้อมูลจีนไทป์นี้จะมีการกระจายตัวที่แตกต่างจาก Hardy-Weinberg equilibrium
- %Geno คือ ค่าเปอร์เซ็นต์การทำจีโนไทป์ที่ได้ผลในแต่ละ marker
- FamTrio คือ จำนวนของครอบครัวที่มีผลจีโนไทป์ครบ
- MendErr คือ จำนวนของครอบครัวที่มีผลจีโนไทป์ไม่เป็นไปตามกฎของ Mendel
- MAF คือ ค่า minor allele frequency ของ marker นี้
- Alleles คือ แสดง major และ minor ของ allele ที่ตำแหน่ง SNP นั้นๆ
- Rating คือ ค่าที่จะใช้บอกให้โปรแกรมทำการวิเคราะห์ผลต่อไป เครื่องหมายถูกหน้า marker ใด
ที่มีอยู่จะหมายถึง ข้อมูลจีโนไทป์ใน marker นั้นๆ ได้ผ่านการทดสอบหมด และ marker
ใดที่ไม่มีเครื่องหมายถูกจะหมายถึงข้อมูลจีโนไทป์ใน marker นั้นๆไม่ผ่านการทดสอบ
ด้วยวิธีใดวิธีหนึ่ง
รูปที่1 แสดงหน้าต่าง check marker ที่กำหนดค่า HW p-value cutoff ที่ 0.0010, ค่า mimimun genotype% ที่
75, ค่า maximum mendel errors เป็น1 และค่า minimum minor allele frequency เป็น 0.0010
จากรูปที่ 1 จะเห็นว่า
1. มี 52 markers ที่มีค่า HWpval มากกว่า 0.0010
2. มี 7 markers ที่มีค่า MAF(minimum minor allele frequency) น้อยกว่า 0.0010 ซึ่งแสดงด้วยตัวเลขสีแดง
3. มี 19 markers ที่มีค่า %Geno (ค่าเปอร์เซ็นต์การทำจีโนไทป์ที่ได้ผลในแต่ละ marker) น้อยกว่า 75 ซึ่งแสดง
เป็นตัวเลขสีแดง
4. มี 19 markers ที่ไม่มีเครื่องหมายถูกที่ค่า Rating (นั่นคือ marker นั้นๆไม่ผ่านการทดสอบด้วยวิธีใดวิธีหนึ่ง
หรือไม่ผ่านค่าที่กำหนดไว้) ซึ่งโปรแกรมจะไม่นำ markers นั้นๆ มาทำการวิเคราะห์ผลต่อไป
เมื่อทำการกำหนดค่า HW p-value cutoff ที่ 0.0500 พบว่าผลที่ได้จากโปรแกรมเป็นดังรูปที่ 2
รูปที่ 2 แสดงหน้าต่าง check marker ที่กำหนดค่า HW p-value cutoff ที่ 0.0500, ค่า mimimun genotype% ที่
75, ค่า maximum mendel errors เป็น1 และค่า minimum minor allele frequency เป็น 0.0010
จากรูปที่ 2 จะเห็นว่า 52 markers ที่มีค่า HWpval มากกว่า 0.0010 (ในรูปที่ 1) เมื่อกำหนดค่า
HW p-value cutoff ที่ 0.0500 พบว่า มี 9 markers ที่มีค่า HWpval น้อยกว่า 0.0500 ซึ่งแสดงเป็นตัวเลขสีแดง
ส่งผลให้ มี markers ที่ไม่มีเครื่องหมายถูกที่ค่า Rating เพิ่มขึ้นจาก 19 markers เป็น 28 markers ซึ่งโปรแกรม
จะไม่นำ 28 markers นั้นๆ มาทำการวิเคราะห์ผลต่อ นั่นคือ มี 24 markers ที่มีเครื่องหมายถูกที่ค่า Rating ซึ่ง
โปรแกรมจะนำ 24 markers นั้นๆ มาทำการวิเคราะห์ผล
2. แสดงภาพ linkage disequilibrium map พร้อมอธิบาย
linkage disequilibrium map (LD map) จะแสดงในแถบ LD plot (กดเลือก แถบ LD Plot) ซึ่งเป็น
การศึกษาว่า marker ที่อยู่ใกล้กันมีโอกาสถ่ายทอดไปด้วยกันมากกว่าหรือน้อยกว่าค่าคาดหวังซึ่งพิจารณาจาก
ค่า Lewontin’s coefficient (D’) ที่คำนวณจากระยะทางและความถี่อัลลีลของแต่ละคู่สนิปส์ หากค่า D’
มากกว่า 0.8 หมายความว่ามีการถ่ายทอดไปด้วยกันของคู่ marker ซึ่งการสร้างบล็อกมาจากการเลือก
พารามิเตอร์ solid spine โดยโปรแกรมจะเลือกตำแหน่งที่มีการถ่ายทอดไปด้วยกันสูง (strong LD) ของ
สนิปส์ตัวแรกและตัวสุดท้ายใน LD chart และสนิปส์ที่อยู่ใน LD จะเรียกว่า haplotype block ซึ่งสีในแต่ละ
block จะแสดงผลการศึกษาค่า LD ข้างต้น แสดงดังตารางที่1
ตารางที่1 แสดงสีซึ่งบอกการถ่ายทอดไปด้วยกันของค่า LD (Standard Color Scheme)
D’<1 | D’=1 | |
LOD<2 | White | Blue |
LOD>2 | Shades of pink/red | Bright red |
หมายเหตุ LOD เป็นค่า log of the likelihood odds ratio
D’ เป็นค่า the value of D’ between the two loci
รูปที่ 3 แสดงภาพ linkage disequilibrium map
จากรูปที่ 3 จะเห็นว่า มีการแบ่งออกเป็น 4 บล็อก มีขนาดที่แตกต่างกันไป ดังนี้
บล็อกที่ 1 มี SNP 2 ตำแหน่ง
บล็อกที่ 2 มีขนาดใหญ่ที่สุดมี SNP 8 ตำแหน่ง
บล็อกที่ 3 มีขนาดเล็กที่สุดมี SNP 2 ตำแหน่ง
บล็อกที่ 4 มี SNP 6 ตำแหน่ง
3. แสดงภาพ Haplotype block พร้อมอธิบาย
Haplotype blocks จะแสดงในแถบ haplotype
รูปที่ 4 แสดงภาพ Haplotype block
จากรูปที่ 4 จะเห็นว่า พบ haplotype block ทั้งหมด 4 บล็อก โดยในบล็อกที่ 1 มี SNP 2 ตำแหน่ง 3
รูปแบบ ในบล็อกที่ 2 มี SNP 8 ตำแหน่ง 6 รูปแบบ ในบล็อกที่ 3 มี SNP 2 ตำแหน่ง 2 รูปแบบ และในบล็อก
ที่ 4 มี SNP 6 ตำแหน่ง 4 รูปแบบ ซึ่งสอดคล้องกับภาพ linkage disequilibrium map(ในข้อที่3)โดย haplotype
block แต่ละกลุ่มมีขนาดแตกต่างกันขึ้นกับปัจจัยคือ การเกิดรีคอมบิเนชั่น (recombination) ในขั้นตอนของ
การสร้างเซลล์สืบพันธุ์ในกระบวนการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิส ทำให้ SNP ที่อยู่ติดกันมีโอกาสที่จะถูก
ถ่ายทอดไปด้วยกันน้อยลง ส่งผลให้เมื่อเวลาผ่านไปหลายชั่วอายุคน haplotype block มีขนาดเล็กลง โดย
โปรแกรมจะคำนวณโอกาสที่จะเกิด recombinant ในแต่ละบล็อกให้ด้วย เช่น ในบล็อกที่1 มีโอกาสที่จะเป็น
AC เท่ากับ 45.8%, มีโอกาสที่จะเป็น CT เท่ากับ 31.0% และมีโอกาสที่จะเป็น AT เท่ากับ 23.2%
จากรูปที่ 4 โอกาสการเกิด recombinant มีได้ 24 แบบ โดยมีรูปแบบดังนี้
1. AC TTACCTAG AC CCCAAG
2. AC TTACCTAG AC TCTACT
3. AC TTACCTAG AC CCCGAG
4. CT TTACCTGG AC CCCAAG
5. CT TTACCTGG AC TCTACT
6. CT TTACCTGG AC CCCGAG
7. CT TTACCTGG GT CTCAAG
8. AT TTACCTAG AC CCCAAG
9. AT TTACCTAG AC TCTACT
10. AT TTACCTAG AC CCCGAG
11. AT TTACCTAG GT CTCAAG
12. AT CCCTTCGT AC CCCAAG
13. AT CCCTTCGT AC TCTACT
14. AT CCCTTCGT AC CCCGAG
15. AT CCATTCGT AC CCCAAG
16. AT CCATTCGT AC TCTACT
17. AT CCATTCGT AC CCCGAG
18. AT CCCTTCGG AC CCCAAG
19. AT CCCTTCGG AC TCTACT
20. AT CCCTTCGG AC CCCGAG
21. AT CCCTTCGG GT CTCAAG
22. AT TCATTTGG AC CCCAAG
23. AT TCATTTGG AC TCTACT
24. AT TCATTTGG AC CCCGAG
รายชื่อสมาชิกในกลุ่ม
1. นางสาวธันย์ณิชา ชำนาญป่า 5214402660
2. นางสาวสโรชา ชูช่วย 5214400705
3. นายกีรติชัยนันต์ จรรยาเพศ 5314400286
4. นางสาวสุภาวดี มนัสวีระพร 5314400472
5. นางสาววีราวัลย์ ปรีชาสิทธิคุณ 5214402686
6. นางสาวสิรินัดดา ร่วมพร 5214402708
